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免疫组织化学染色(免疫组化)

编辑:   上传日期:2015-07-20  阅读次数:

一、原理
免疫组织化学技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理,检测组织中的肽和蛋白质的一种技术。现常用以下两种检测方法:
SP法:
一抗 + 生物素标记二抗 + 辣根酶标记链霉卵白素 + 辣根酶底物显色
SABC法:
一抗 + 生物素标记二抗 + SABC(链霉卵白素 + 辣根酶标记生物素) + 辣根酶底物显色
一般来说,SP法特异性较高,SABC法敏感性较高。

免疫组化最终显色反应是通过酶与底物作用生成不溶性色素而完成的,所选用底物与呈色反应密切相关。最常用的是DAB,呈棕黄至棕褐色沉淀。 

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免疫组化


二、材料和试剂
1.试剂:酒精、二甲苯、枸橼酸盐、PBS、一抗、二抗试剂盒、DAB、树胶等。
2. 仪器设备: 载玻片、染色缸、湿盒、移液器、微波炉、恒温箱、冰箱、显微镜等。

三、染色程序
1.切片脱蜡至水;二甲苯Ⅰ(15分钟)→二甲苯Ⅱ(15分钟)→无水乙醇Ⅰ(5分钟)无水乙醇Ⅱ(2分钟)→90%乙醇(2分钟)→80%乙醇(2分钟)→70%乙醇(2分钟)→蒸馏水(2分钟)。
2. 3% H2O2,室温10-20分钟,灭活内源性酶。(30% H2O2 1份+双蒸水9份混合配制新鲜) 
PBS洗2分钟×2次;
3.微波修复:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液PH6.0)电炉或微波炉加热至沸腾后断电,间隔2~3分钟后,重复2~3分钟,自来水浴冷至室温,PBS洗2分钟×2次;
4.滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟, 不洗,甩去多余液体。阻断组织与抗体非特异性结合,降低背景染色;
5.滴加Ⅰ抗(浓缩液要适当比例稀释,滴加量要根据组织大小,1cmⅩ1cm大小40ul左右),37℃1-2小时或4℃过夜;PBS洗5分钟×3次;
6.滴加生物素化二抗, 37℃或室温30分钟,PBS洗5分钟×3次;
7.滴加试剂复合物,37℃或室温30分钟,PBS洗5分钟×3次;
8.DAB显色:使用DAB显色试剂盒,室温显色,镜下控制反应时间,一般在5分钟之内;
9.流水冲洗;
10.苏木精复染2分钟;
11.流水蓝化15分钟;
12.干燥箱烤干、二甲苯透明、中性树胶封片,置入烤箱烤片。

四、注意事项
1.切片要尽量薄、平、无刀痕;
2.滴加试剂前要先甩去切片PBS,再用吸水纸把组织周围的水擦干,防止抗体流失分散,但不能干片。

免疫组化相关试剂:
振动切片封闭液(PNBS): (10ml)
 终浓度:                          储液:
 10%NS(二抗种属正常动物血清)       NS             1ml
 2%BSA                             10%BSA         2ml
 5%蔗糖                            20%蔗糖        2.5ml  
          +PBS PH7.4   to    10ml
 
MEMFA:(10ml) 
 终浓度:                          储液:
0.1M MOPS                         1M MOPS         1ml
0.1mM EGTA                        10mM EGTA       2ml
1mM MgSO4                         1M MgSO4        10μl
3.7%PFA                           10%PFA          3.7ml    
         +d2H2O     to    10ml
 
AP-CDS:(100ml)                             
 终浓度:                            储液:
      100mM Tris-Cl PH9.5                 1MTris-Cl PH9.5     10ml
      50mM MgCl                           1M MgCl             5ml
      100mM NaCl                          5M NaCl             2ml
      0.1% Tween-20                       Tween-20            100ml
      5mM levamisole                      1M levamisole       500ml                 
                                                         +d2H2O     to    100ml
 
HRP-CDS: (1ml)
(1)6.6ml H2O2 in 100ml 0.1M TB PH 7.5
(2)20ml DAB(0.05g/ml in d2H2O)+5ml(1)液+0.1M TB PH 7.5  to  1ml
 
10%多聚甲醛配制方法:(100ml)
称取10克多聚甲醛(SIGMA P6148)粉末,置于250ml锥形瓶中,加入80ml 1xPBS,再加入5-6滴(1ml吸头)10N NaOH, 于65°C水浴中溶解3-4小时,完全溶解后冷却至室温,调整PH值至7.4, 溶液定容至100ml,过滤后分装成每管4ml 或8ml, 保存于-20°C。使用前将贮液置于80°C水浴中溶解,1xPBS稀释至4%,即可使用。(配好后4°C密闭保存,24小时内使用。)
    或直接配制4%PFA, 方法同上(可不加NaOH促溶,则不用调PH),配好后4°C密闭贮存,24小时内使用。 

0.5%明胶处理载玻片方法:
800ml处理液:
1.溶解4g 明胶和4g硫酸铬钾于 800ml d2H2O中,65°C加热30min左右,使其溶解(不要使溶液沸腾)
2.过滤溶液,并将溶液在室温下放置至50°C左右。
3.将玻片在溶液中浸提3-4次。
4.将处理的玻片在室温下过夜使其蒸发干,为防止灰尘,用保鲜膜覆盖。
5.130°C烤干3小时以上。
6.干燥保存。
处理液使用后,可加入0.05%NaN3,4°C保存。下次使用时将溶液加热至50°C即可。 

蛋白胶配制方法:
取新鲜鸡蛋清充分搅拌, 4°C过滤,清液加入等体积无荧光甘油,再加入0.05%NaN3充分混合,分装成每管1ml,-20 °C保存。 

荧光封片剂(Mowiol)配制方法:(约24ml)
将2.4g mowiol、6g甘油和6ml去离子水放入 50ml 离心管中,室温2小时,直至mowiol完全长大变透明。加12ml0.2M Tris buffer (pH 8.5),50°C(过夜),直到mowiol完全溶解。4000-5000 rpm 离心20 minutes。分装成每管1ml,-20°C保存。
 

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