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蛋白印迹(Western Blot)实验技术服务

编辑:   上传日期:2015-08-17  阅读次数:

上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

Western印迹分析

表达水平的Akt和磷酸化Akt在肿瘤的老鼠

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蛋白印迹原理


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蛋白印迹实例


蛋白印迹法(Westernblotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法,如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

蛋白印迹(Western Blot)显色的方法主要有以下几种:
1. 放射自显影
2. 底物化学发光ECL
3. 底物荧光ECF
4. 底物DAB呈色

免疫印迹基本步骤:
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中加入含有SDS,其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮5分钟变性使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成棒状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料,溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳。另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部。最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-glycine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂,通常是SDS。Tris-glycine可用于分离很宽分子量范围(6 - 200 kDa)的蛋白质,并且与变性或非变性条件相容。

免疫印迹法分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)——>电转移——>酶免疫定位。免疫印迹检测的具体操作过程存在很大差异。其中最常见的是直接和间接检测,间接检测法即一抗首先与抗原结合,再加入能与一抗特异结合标记过的二级抗体。标记物包括生物素、荧光探针(如荧光素和罗丹明)和酶(如HRP和AP)。这种方法的优点是单个二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体,另一方面一抗通常能与几个二抗分子结合,从而起了信号放大的作用。其缺点是检测过程增加了额外的温育步骤。


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