新葡京在线

cnenjpkr

资讯动态

行业资讯

您当前的位置:新葡京在线 > 资讯动态 > 行业资讯 > 美迪西细胞凋亡检测技...

美迪西细胞凋亡检测技术服务

编辑:   上传日期:2016-01-29  阅读次数:

上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。了解服务详情

细胞水平分析

技术平台

细胞毒性检测

细胞凋亡检测分析

细胞迁移分析

细胞侵袭分析

HTRF细胞水平检测分析

免疫染色分析

免疫荧光分析(96/384孔板)

报告基因分析(绿色荧光蛋白/荧光素梅)

放射性配体受体结合试验

细胞摄取分析

基因敲除分析

RNA干扰法

MicroRNA过表达分析

MicroRNA敲除分析

有关腺病毒/逆转录病毒/慢病毒 载体的应用分析


细胞凋亡或称程序性细胞死亡(PCD)是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程,在形态学和生化有其明显的特征,是有别于细胞坏死的细胞死亡方式。研究细胞凋亡的方法有很多,如形态学观察,琼脂糖凝胶电泳,原位末端标记法,流式细胞仪检测等。

细胞凋亡检测


细胞凋亡时,形态上,早期细胞核固缩,染色体边集在核膜内侧显新月体形,核碎裂;细胞体积变小,细胞浆和细胞器密度增高;线粒体正常或轻微肿胀;细胞膜皱折、卷曲,但早期细胞膜仍保持完整;细胞膜出泡,芽生形成膜包裹的凋亡小体,内含完整的细胞器和核碎片。在组织中,凋亡小体常迅速被邻近细胞吞噬,由于细胞内容物不外溢,故周围组织中无炎症反应。而细胞坏死时,细胞体积变大,线粒体明显肿胀,在早期细胞膜的完整性即被破坏,胞浆内容物外泄,引起局部炎症反应或组织损伤。核的变化发生较晚,主要是核溶解和消失。无凋亡小体形成。

形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法,主要有普通光学显微镜观察方法,透射电子显微镜观察方法和荧光显微镜观察方法等,以下先容普通光学显微镜观察方法中的HE染色法以及荧光显微镜观察方法中的吖啶橙染色法和吖啶橙/EB染色法。

细胞凋亡检测

细胞凋亡检测方法

方法一 苏木素——伊红染色(HE染色法)
【原理】苏木素容易被氧化,其氧化产物苏木红与铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精,与带负电荷的脱氧核糖核酸酸根吸附而使细胞核染色。染色后必须进行分化(differenciation)和蓝化(blueing)处理。所谓分化,就是用某些试剂,将过度染色的或不需着色的组织成分上的颜色除去。所谓蓝化是指用明矾苏木素液深染细胞核后,通过盐酸乙醇分化,切片从酸性环境中(此时,切片呈红褐色)转移至流水中使之变蓝的过程。
伊红Y(四嗅荧光素二钠盐)是一种酸性染料,可使细胞的胞浆染成粉红色。

方法二 吖啶橙染色法
【原理】吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料,它可通过与DNA和RNA的连接碱基对和磷酸盐基团结合,使细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。吖啶橙在稀溶液中呈绿色;在浓溶液中,由于出现二聚体和多聚体而呈现橙红色。由于DNA是高度聚合物,吸取荧光物质的位置较少,故发绿色荧光;而RNA聚合度低,能和荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。

方法三 吖啶橙/EB双染色法
【原理】用吖啶橙染色可以检测细胞凋亡,但不能区别活细胞和死细胞。溴化乙锭(EB)仅着染死细胞,可使DNA染成桔红色,而仅很弱地结合RNA使之呈红色。因此将吖啶橙和溴化乙锭混合使用,可根据两种染料的吸取情况鉴定死细胞和活细胞。

方法四 琼脂糖凝胶电泳法
【原理】在细胞凋亡过程中,内源性核酸内切酶被激活,该酶优先作用于连接DNA的核小体间区域,将DNA链切割成为180~200bp或其整倍数的片段。将这些DNA片段抽提出来进行琼脂糖凝胶电泳,即可出现梯状电泳图谱。坏死细胞的DNA随机降解,并伴组蛋白的降解,故在凝胶电泳时呈模糊、弥散膜状条带。

方法五 原位末端标记技术
细胞凋亡中,染色体DNA的断裂是一渐进的分阶段的过程,其首先在内源性核酸水解酶的作用下降解为50~300kbp的DNA大片段。然后大约30%的染色质DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,从核小体间将DNA链切割成为180~200bp或其整倍数的寡核苷酸片段。染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,并通过一定的显示系统使之显示出来,从而可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,所以很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学法和DNA ladder测定法要高,且能早期显示尚未发生典型形态变化的凋亡细胞,是检测单个细胞早期出现凋亡现象的较好方法,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
【原理】在TdT酶的作用下,生物素(biotin)标记的dUTP可以参入到凋亡细胞DNA断链的3'-OH末端,并可与连接了过氧化物酶(POD)的亲和素(streptavidin)特异结合,POD可催化底物DAB产生很强的颜色反应,特异准确地定位凋亡细胞,因而在普通光学显微镜下,即可观察和计数凋亡的细胞。

方法六 亚G1峰检测法
【原理】处于增殖周期中的细胞,根据其所处不同周期时相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之间。凋亡细胞的重要特点就是细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解。在乙醇固定和去垢剂处理后,凋亡细胞的细胞膜通透性增加,导致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,以DNA特异性荧光染料染色后,形成一个DNA含量小于2n(即小于G0/G1期细胞)的分布区。 用流式细胞仪分析,可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰(Sub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak, 也叫凋亡峰)。代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。

方法七  Annexin V-FITC凋亡检测

【原理】正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和发生继发坏死的细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将Annexin Ⅴ与PI匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及继发坏死的细胞区分开来。

联系大家

邮箱:marketing@medicilon.com.cn

电话:02158591500


相关内容推荐

上一篇:2015vs1996:两大新药批准高峰有何不同

下一篇:盘点美国FDA批准上市的转基因动植物生产的新药

XML 地图 | Sitemap 地图