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细胞转染技术服务

编辑:   上传日期:2016-01-27  阅读次数:

细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。

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技术内容:将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞 
研究内容:研究和控制真核细胞基因功能 
应用:基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验

细胞转染的分类

1、瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控原件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。
目的:快速分析
筛选方法:抗生素抗性
表达持续时间:随细胞分裂而稀释至丢失48-72小时 
目的DNA与宿主染色体:未整合

2、稳定转染:外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整个率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1、104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶,潮酶素B磷酸转移酶,胸苷激酶等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
目的:为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆 
筛选方法:抗生素抗性
表达持续时间:随宿主细胞本身基因组一样复制,转录,翻译,并被稳定遗传 
目的DNA与宿主染色体:未整合

常见细胞转染方法先容

1、DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始,但用于稳定转染却不可靠。
2、磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是,先将DNA和氯化钙混合,然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀,后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上,通过胞膜的内吞作用摄人DNA。
3、脂质体介导法(目前应用最广泛)
原理:阳离子脂质体试剂与DNA混合后,形成一种稳定的脂质双层复合物,DNA被包在脂质体中间,这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中,脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合,DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染  稳定转染. 
【特点】:使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,很大程度上应用受限制。
4、物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)

脂质体介导法实验方法先容

细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂:以HEK193细胞为例:
转染前一天,将细胞铺到培养皿中,
加入有血清无双抗的培养基(15ml);
24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml;
将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释;取40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养基稀释,室温放置5min;
5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起,室温放置20min后加入培养皿中,4h后换上完全培养基48h培养;
注:24h看一次,如果培养基变颜色换培养基;

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