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包涵体蛋白纯化和复性

编辑:   上传日期:2016-01-25  阅读次数:

包涵体:在某些生长条件下,基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体。(Inclusion Bodies,IB)。

包涵体的组成及特性

一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um,难溶与水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体与蛋白种类及表达系统无关,仅为蛋白过量表达的结果。

包涵体形成的主要原因

1、表达量过高:原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能完全正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。       

2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体 

3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高(37-42℃)或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤

           破碎细胞
           (Disruption of cell)
           ↓
             分离包涵体
     (Seperation of inclusion body)
            ↓
             溶解包涵体
     (Dissolve inclusion body)
               ↓

               蛋白质产物的构象复原等。

         (Recovery of target protein conformation)

包涵体蛋白纯化和复性的基本步骤

包涵体蛋白纯化和复性的步骤


蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同,所处的环境不同,使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件,只有选择到了合适的复性缓冲液,使蛋白得以正确折叠,才能使进一步的层析分离得以顺利完成。 

美迪西包涵体蛋白复性特点

活性蛋白的回收率高
正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。
折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品
复性过程耗时少

复性常用方法

1、稀释复性:直接加入水或复性缓冲液,缺点是体积增加较大,后续处理困难。
稀释蛋白浓度:浓度高则容易形成聚集体(较低的复性收率)。有时需低于0.01mg/mL。
脉冲流加复性:分批次加入到缓冲液中,使折叠中间体保持在较低的水平。例:在5-10mg/mL终浓度下,溶菌酶复性收率可达80%以上。
2、透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,速度慢,不适合大规模操作,无法应用到生产规模。
3、超滤复性:选择合适载留分子量的膜,允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用,规模较大,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性(蛋白聚集于膜上)。
4、色谱复性:辅助手段,兼具分离。
4.1凝胶过滤复性:除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外,蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用,并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢,对有些蛋白质的复性有利。
4.2吸附型层析复性:离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后,将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上,然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白,最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来,在洗脱过程中完成复性。
5、分子伴侣:主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡,而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。

体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达;体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解,再加入分子伴侣帮助折叠。

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